Современный гематологический анализатор является техническим устройством, которое обеспечивает выполнение аналитического процесса – определение клеточного состава крови человека в автоматическом режиме.
После ввода пробы крови в анализатор внутри прибора выполняются следующие процедуры: приготовление двух разведений введенной пробы крови: первое разведение - для подсчета концентрации лейкоцитов (в нем же после лизиса эритроцитов подсчитывается концентрация гемоглобина), и второе разведение – для подсчета концентрации эритроцитов и тромбоцитов.
Первое разведение крови получается путем дозирования цельной крови (обычно 10 – 20 мкл) и изотонического разбавителя (5 – 10 мл) с последующим добавлением лизирующего раствора, который разрушает эритроциты и преобразует все формы гемоглобина к одной форме.
Второе разведение крови получается путем дозирования первого разведения крови (обычно 50 – 100 мкл) (до того как в него добавляется лизирующий раствор) и изотонического разбавителя (5 – 10 мл).
На втором этапе анализатор определяет концентрации клеток крови в приготовленных разведениях, анализирует индивидуальные характеристики клеток крови: объем, свойства пропускания и рассеяния света; измеряет концентрацию производной формы гемоглобина. Для этого часть первого разведения крови по магистралям анализатора поступает в специальное устройство, которое подсчитывает лейкоциты, другая часть первого разведения поступает в проточную кювету гемоглобинометра, а второе разведение крови поступает в устройство, которое подсчитывает эритроциты и тромбоциты. Для расчета концентраций клеток при их подсчете измеряется объем разведения крови, прошедшего через устройство подсчета клеток.
На третьем этапе прибор выполняет комплекс вычислений, в результате которых получаются конечные данные анализа, и выводит на дисплей и на печать эти данные.
Ввод пробы крови в анализатор
В настоящее время в разных гематологических анализаторах реализованы четыре варианта ввода пробы крови:
1. Ввод цельной (стабилизированной ЭДТА) крови из открытой пробирки.
Открытая пробирка с венозной или капиллярной кровью (стабилизированной ЭДТА), подносится к заборной игле прибора и поступает во внутренние магистрали прибора.
2. Ввод цельной крови из герметично закрытой пробирки.
Герметично закрытая резиновой пробкой пробирка с кровью (стабилизированной ЭДТА), устанавливается в специальное устройство в анализаторе. Резиновая пробка автоматически прокалывается специальной иглой, через которую кровь поступает в магистрали анализатора. Этот ввод применяется в тех случаях, когда при взятии крови были использованы вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА (вакутейнеры).
3. Ввод предварительно разведенной крови из открытой пробирки.
Данный способ применяется в тех случаях, когда первое разведение крови выполняется вне анализатора. Для этих целей в приборе имеется дополнительная заборная игла, к которой подносится разведенная кровь и через которую проба поступает в анализатор прямо в емкость для первого разведения крови.
4. Ввод крови из микрокапилляра
Этот метод применим в том случае, если забор капиллярной крови проводился с использованием специальных микрокапилляров объемом 20 мкл (прецизионные end-to-end капилляры). Микрокапилляр с кровью помещается в специальный адаптер, который затем вставляется в сециальный разъем гематологического анализатора.
Следующий этап - дозирование цельной крови для приготовления первого разведения
Для выполнения этой операции в гематологическом анализаторе используется один из трех методов:
- Шприцевой дозатор.Игла для ввода цельной крови (первый или второй способ ввода) подключена магистралью к шприцевому дозатору. При перемещении поршня дозатора на определенное расстояние, кровь в объеме 10 - 20 мкл, всасывается в иглу, после чего игла перемещается внутрь прибора и за счет движения поршня дозатора в обратном направлении кровь вытесняется из иглы в емкость для первого разведения.
- Поворотный клапан. Кровь через иглу ввода заполняет входную магистраль и канал поворотного клапан, который имеет точно заданный объем. Затем канал поворотного клапана, заполненный кровью, автоматически подключается к магистрали, по которой подается изотонический разбавитель.
- Прецизионный микрокапилляр.Этот метод может применяться, если гематологический анализатор оснащен специальным адаптером для ввода крови из микрокапилляров (четвертый метод ввода пробы). После установки адаптера с микрокапилляром в анализатор по магистрали подается изотонический разбавитель точно заданного объема, который вымывает из капилляра кровь в емкость для первого разведения.
Наиболее точным и надежным методом дозирования цельной крови является второй – метод поворотного клапана. Коэффициент вариации объема дозирования менее 1%. При этом минимальный объем крови, который необходимо взять у пациента, составляет 55 – 150 мкл. Это связано с тем, что кровь должна заполнить магистраль перед каналом поворотного клапана (60 – 130 мкл) и сам канал поворотного клапана (20 мкл).
Метод прецизионного капилляра позволяет минимизировать объем взятия крови до 20 мкл, что актуально, например в педиатрии и неонатологии – кровь можно вводить в капилляр непосредственно из места прокола (палец, пяточка). Погрешность дозирования в этом случае определяется точностью изготовления микрокапилляров. Коэффициент вариации обычно не превышает 1,5%.
При использовании шприцевого дозатора в иглу забирается также малый объем крови (10 – 20 мкл). Однако, поскольку к игле анализатора кровь должна быть доставлена в пробирке, на практике минимальный объем крови составляет 100 - 200 мкл. Меньшее количество крови забирать нельзя, потому что кровь, как жидкость, обладающую высокой вязкостью после седиментации клеточных элементов, будет практически невозможно перемешать.
В то же время следует отметить, что перемешивание крови перед проведением измерения на гематологическом анализаторе – обязательная процедура преаналитического этапа. Она необходима для обеспечения однородности пробы крови по клеточному составу во всем объеме исследуемого образца.
Несоблюдение этого правила приводит к существенным искажениям измеряемых параметров! Обращаем также Ваше внимание на то, что шприцевой дозатор является наименее надежным элементов в анализаторе и требует достаточно частого (в зависимости от интенсивности эксплуатации) ремонта.
Точность дозирования шприцевым дозатором неизбежно снижается вследствие износа уплотнительных элементов в процессе эксплуатации прибора.
Подсчет клеток крови, анализ их характеристик
Для выполнения этой процедуры в подавляющем числе типов гематологических анализаторов используется кондуктометрический метод. Этот метод основан на эффекте изменения электрического сопротивления микроотверстия (трансдьюсера) при прохождении через него клетки крови. Величина изменения сопротивления пропорциональна объему клетки. Это позволяет различать тромбоциты и эритроциты при их одновременном подсчете. Для подсчета лейкоцитов предварительно производится лизис эритроцитов. Устройство трансдьюсера во всех современных гематологических анализаторах практически одинаковое.
Концентрация клеток определяется как отношение числа подсчитанных клеток к объему разведения пробы, которое прошло через трасдьюсер. Для определения объема пробы, прошедшей через трансдьюсер при подсчете клеток используется один из двух методов:
- Метод фиксированного времени.В этом методе по обе стороны трансдьюсера создается разность давлений точно заданной величины. При этом предполагается, что за определенное время через микроотверстие проходит точно известное количество пробы. Для чистого раствора это предположение абсолютно верно. Однако при измерении разведенной крови иногда возникают засоры микроотверстия, что приводит к ошибкам в определении концентрации клеток. Чаще всего это возникает при подсчете лейкоцитов. Кроме того, по мере износа вакуумного насоса в процессе эксплуатации, разность давлений по обе стороны трансдьюсера изменяется, что ведет к изменению количества измеряемой пробы.
- Метод измерительного цилиндра.В этом методе используется специальное устройство, которое позволяет точно фиксировать объем пробы, прошедшей через трансдьюсер. В данном случае небольшое изменение пропускной способности трансдьюсера из-за засорения микроотверстия не приводит к возникновению ошибки в определении концентарции, а приводит лишь к увеличению времени, в течение которого проводится измерение концентрации клеток.
Проблема засорения микроотверстия трансдьюсора присутствует во всех гематологических анализаторах. Поэтому инженеры постоянно совершенствуют технологию очистки микроотверстия. Один из наиболее часто применяемых методов – метод обратного потока.
При засорении микроотверстия через него под достаточно большим давлением в обратном направлении пропускается поток изотонического разбавителя. Это приводит к вымыванию засорения из микроотверстия. Осадок белков и липидов на стенки микроотверстия не всегда отмывается потоком изотонического разбавителя. В этом случае необходимо применять специальный очищающий раствор, содержащий детергенты и протеолитические ферменты. В качестве очищающего раствора иногда применяют гипохлорид натрия.